自然衰老过程中小鼠海马神经发生的改变

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.11.007

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (11): 1564-1569.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.11.007

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自然衰老过程中小鼠海马神经发生的改变

刘品月¹，晋贞超¹，邓小兰¹，袁莉¹，郑敏^1，王亚平¹，王健²，姜蓉¹

¹重庆医科大学干细胞与组织工程研究所，重庆市 400016；²重庆医科大学附属第二医院神经内科，重庆市 400016

收稿日期:2016-01-13 出版日期:2016-03-11 发布日期:2016-03-11
通讯作者: 姜蓉，高级实验师，重庆医科大学干细胞与组织工程研究室，重庆市 400016
作者简介:刘品月，女，1989年生，河南省尉氏县人，汉族，2015年重庆医科大学毕业，硕士，主要从事神经干细胞生物学研究。
基金资助:
国家自然科学基金(31100985)；重庆市自然科学基金(CSTC2010BB5096)

Changes of mouse hippocampal neurogenesis during aging

Liu Pin-yue¹, Jin Zhen-chao¹, Deng Xiao-lan¹, Yuan Li¹, Zheng Min¹, Wang Ya-ping¹, Wang Jian², Jiang Rong¹

¹Institute of Stem Cells and Tissue Engineering, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China; ²Department of Neurology, Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China

Received:2016-01-13 Online:2016-03-11 Published:2016-03-11
Contact: Jiang Rong, Senior experimentalist, Institute of Stem Cells and Tissue Engineering, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
About author:Liu Pin-yue, Master, Institute of Stem Cells and Tissue Engineering, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31100985; Chongqing Natural Science Foundation, No. CSTC2010BB5096

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

自然衰老：人体在生长发育达到成熟后，随年龄的增加，细胞的增殖分化能力和生理功能逐步下降，维持机体内环境稳定能力与应激能力下降，从而导致组织器官结构、功能衰退的不可逆的生理过程。随着机体进入衰老进程，在外表上表现为白发增多、皮肤褶皱；在行为上表现为行动迟缓，步履蹒跚；在中枢神经系统则表现为记忆力减退、学习能力下降。

海马神经发生：传统的研究认为，神经元是高度分化的细胞，人出生后就不会再有新的神经元出现，并且神经元处在一种连续不断地死亡且永不复生增殖的过程，直至消亡殆尽。但后续研究发现，成年哺乳动物脑内海马和侧脑室下区的神经干细胞可以不断的增殖分裂产生新的神经元，这个过程叫做“神经发生”。海马齿状回神经干细胞在分化的同时向颗粒细胞层(GCL)进行了短距离的迁移，这些神经干祖细胞最终在颗粒层成熟并参与到神经回路中，这个过程即为海马神经发生。

背景：多篇文献报道在衰老期海马神经发生出现障碍，最终导致学习记忆能力的减退。但是究竟哪个环节的改变导致这种减退的发生并不明确。

目的：了解衰老过程中小鼠海马齿状回颗粒下层神经发生的改变。

方法：选取3个年龄组的小鼠，免疫组织化学法观察海马齿状回颗粒下层神经干细胞(nestin⁺)、成神经细胞(Doublecortin⁺，DCX⁺)和增殖细胞(PCNA⁺)的个数；反转录PCR观察海马衰老相关基因p19^Arf、p21^{Cip1/ Waf1}mRNA的表达。

结果与结论：老年组与青年组和中老年组相比PCNA⁺细胞、nestin⁺细胞与DCX⁺细胞数量明显减少；p19^Arf、p21^Cip1/Waf1mRNA表达明显增强。结果说明，衰老小鼠海马齿状回颗粒下层细胞增殖减少，神经干细胞数量减少，向神经元方向分化减少，颗粒下层区神经发生下降可能与增殖相关基因表达增加相关。提示自然衰老过程中海马组织神经发生的下降可能与p19^Arf-Mdm2-p53-p21^Cip1/Waf1信号通路中p19^Arf、p21^Cip1/Waf1的表达上调有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0002-8390-3090(刘品月)

关键词: 组织构建, 组织工程, 衰老, 海马, 神经发生, 颗粒下层, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Abnormal hippocampal neurogenesis during aging has been reported to result in learning and memory dysfunction. But its mechanism is unclear.
OBJECTIVE: To understand the changes of mouse neurogenesis in the hippocampal subgranular zone during aging.
METHODS: C57BL/6 mice 2, 6 and 20 months of age were used. Immunochemistry was used to count the number of neural stem cells (nestin+), neuroblasts (Doublecortin+, DCX+), and proliferative cells (proliferating cell nuclear antigen+, PCNA+) in the hippocampal subgranular zone. mRNA expressions of aging-related genes, p19Arf and p21Cip1/Waf1, in the hippocampus were detected by reverse transcription-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the young and middle age groups, the number of PCNA+ cells, nestin+ and DCX+ cells in the hippocampal subgranular zone of the aged group decreased dramatically; the expression of p19Arf and p21Cip1/Waf1 mRNA increased in the aged group. Proliferation activity, the number of neural stem cells and neuronal differentiation all decreased. These findings indicate that the decline of hippocampal neurogenesis may be associated with increased expression of aging-related genes p19Arf and p21Cip1/Waf1 in the p19Arf-Mdm2-p53-p21Cip1/Waf1pathway.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

刘品月，晋贞超，邓小兰，袁莉，郑敏，王亚平，王健，姜蓉. 自然衰老过程中小鼠海马神经发生的改变[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(11): 1564-1569.

Liu Pin-yue, Jin Zhen-chao, Deng Xiao-lan, Yuan Li, Zheng Min, Wang Ya-ping, Wang Jian, Jiang Rong. Changes of mouse hippocampal neurogenesis during aging[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(11): 1564-1569.

图/表（结果） 4

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计分组对比观察动物实验。

1.2 时间及地点实验于2012年11月至2013年6月在重庆医科大学干细胞与组织工程研究室完成。

1.3 材料

实验动物及分组：健康C57/BL雄性小鼠18只由重庆医科大学动物实验中心提供，按年龄分为A青年组(2至3个月)，B中年组(6个月)，C老年组(20个月)，每组6只。

主要设备和药品试剂：光学显微镜及成像系统(日本奥林巴斯)；梯度PCR仪、Gel Doc 1000 凝胶成像系统(美国百乐公司)；一抗nestin，兔抗鼠(美国sigma)；DCX兔抗鼠，PCNA大鼠抗鼠(武汉博世德)；免疫组织化学二抗试剂盒、DAB显色剂(中杉金桥)：阳离子防脱玻片(北京鼎国昌盛)：中性树脂(上海懿洋公司)；PCR引物、反转录试剂盒、PCR试剂盒、RNA提取试剂RNAisoPlus、Marker(1 000 bp) (TaKaRa(大连)公司)；琼脂糖(西班牙Biowest公司)；GoodViewTM核酸染料(北京赛百盛基因技术有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物取材、制片每组随机取3只动物，经体积分数4%水合氯醛麻醉后，左心室插管，40 g/L多聚甲醛灌注内固定；开颅取脑置于40 g/L多聚甲醛中外固定 24 h后进行常规石蜡包埋；将各组包埋好的组织块，行冠状连续切片，片厚5 μm。

1.4.2 免疫组织化学染色根据解剖定位标志，取相同部位的海马冠状切片。常规脱蜡，水化；煮沸法抗原修复，滴加体积分数3%H₂O₂常温孵育10 min，PBS洗3 min× 3次，0.3%TritonX-100 室温孵育(PCNA：30 min，DCX：10 min)后，用体积分数10%的山羊血清封闭液，室温 30 min，倾去；滴加一抗稀释液：nestin抗体(1∶200)，PCNA(1∶80)；DCX(1∶80)稀释，4 ℃孵育过夜(> 8 h)，PBS洗3 min×3次；通用生物素化二抗，37 ℃孵育 30 min，PBS洗3 min×3次；滴加辣根过氧化物酶标记链霉素工作液 37 ℃孵育30 min，PBS洗3 min×3次；DAB 显色，镜下控制显色时间，流水冲洗后脱水、透明，中性树脂封固。免疫组织化学过程中均以PBS代替一抗设置阴性对照。在40×10光镜下对海马齿状回表达nestin、PCNA、DCX拍照，用ImageJ进行阳性细胞进行计数。

1.4.3 海马衰老相关基因p19^Arf、p21^Cip1/Waf1mRNA的表达

海马RNA提取：动物断头取脑，在冰盘上分离海马置于无酶EP管中，加1 mL的裂解液RNAiso FLUS，匀浆，颠倒混匀，室温静置5 min后进行RNA酚氯仿抽提；紫外分光光度计测定总RNA的A₂₆₀/A₂₈₀值，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。

引物的设计合成：在GenBank检索得到基因的cDNA序列，利用引物设计软件设计相应的PCR引物。GAPDH上游引物：5’-GTG CTG AGT ATG TCG TGG AGT CT-3’，下游引物：5’-GAG TGG GAG TTG CTG TTG AAG T-3’，目标片段602 bp；p19^Arf上游引物：5’- AAG AAG TCT GCG TCG GCG AC-3’，下游引物：5’-AGT ACC GGA GGC ATC TTG GAC A -3’，目标片段215 bp；p21^Cip1/Waf1上游引物：5’-ATT CCT GGT GAT GTC CGA CC-3’，下游引物：5’- AAA GTT CCA CCG TTC TCG G -3’，目标片段144 bp。

RT-PCR检测：cDNA合成：5xPrimeScript Buffer 2 μL，PrimeScriptRT Enzyme Mix 0.5 μL，Oligo dT Primer (50 μmol/L) 0.5 μL，Random 6 mers (100 μmol/L) 2 μL，Total RNA 1 μL，加入RNase-free dH₂O至10 μL，混合均匀37 ℃加热15 min，85 ℃ 5 s。扩增：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，目的基因上下游引物各1 μL，内参上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，加灭菌蒸馏水至20 μL。扩增条件：预变性94 ℃ 2 min，1个循环；变性94 ℃ 30 s，退火：p19^Arf 58 ℃ 40 s，p21^Cip1/Waf1，GAPDH 55 ℃ 40 s，延伸72 ℃ 40 s，35个循环；延伸72 ℃ 40 s，1个循环。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统对基因条带进行扫描成像。

基因表达半定量分析：Quantity One软件(Bio Rad)分析电泳图上每条基因条带吸光度值。计算各个样本的强度与内参的比值。

1.5 主要观察指标 ①不同年龄组小鼠海马齿状回颗粒下层区nestin细胞数量。②不同年龄组小鼠海马齿状回颗粒下层区细胞增殖情况。③不同年龄组小鼠海马颗粒下层神经元方向分化情况。④衰老小鼠海马组织衰老相关基因p19^Arf、p21^Cip1/Waf1mRNA的表达。

1.6 统计学分析采用SPSS 18中文版软件进行两样本之间的t 检验，P < 0.05说明差异有显著性意义。

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讨论

新生神经元和神经环路的改变可能是导致年龄相关的认知障碍的原因^[14]。文献报道成年海马齿状回的颗粒细胞下层细胞增殖，新生的细胞移行一段距离分化成颗粒细胞，成熟的神经元在分子层及多形层产生树突、轴突，形成突触联系，成为新的神经元，最终整合至海马功能的神经环路中，参与学习、记忆、认知等高级的脑功能^[5-6]。因此，可以推测因为衰老期海马齿状回神经发生的下降，导致了学习、记忆、认知能力下降等衰老症状。本实验对哺乳动物衰老过程中海马神经发生的改变进行深入的探索，为改善学习、记忆能力药物的研究提供实验依据。

增殖是神经发生的初始阶段。PCNA是DNA聚合酶6的辅助因子，参与DNA合成和修复，是评价细胞增殖状态的较好指标^[15]。PCNA在细胞核内合成，在DNA复制和修复中起着关键作用^[16]。PCNA在静止期细胞无明显表达，G₁晚期开始增加，S期达到高峰，G₂期明显下降，M期几乎测不到，阳性表达表明细胞处于活跃的细胞增殖状态^[17]。检测海马颗粒下层区PCNA的表达情况，可以反映该区域细胞增殖活跃程度。对PCNA⁺细胞计数结果发现20月龄的小鼠与2月龄的小鼠相比，海马颗粒下层处于增殖活跃期的细胞明显减少，增殖能力下降可能是导致该区域神经发生减少的原因之一。Nestin是神经干细胞表达的一种中间丝蛋白。海马齿状回神经干细胞为未分化时细胞形态呈胶质细胞样，向颗粒下层投射，表达nestin；随着神经干祖细胞分化、迁移的完成，nestin逐渐消失^[18]。作者观察到Nestin阳性细胞数，在增龄过程中逐渐减少，在2个月龄到6个月之间锐减，之后缓慢减少，这与文献报道一致^[19]，即衰老过程中小鼠海马齿状回神经干细胞的数量是持续减少的。Doublecortin (DCX)是一种微管相关蛋白，其特异地表达于迁移状态的神经祖细胞^[20]，并短暂的表达于迁移到目的地，并展开突起的神经元^[21]。DCX仅在神经发生过程中表达，出现比NeuN早。因此，观察DCX表达情况可以反映神经干细胞向神经元方向分化情况。实验观察到青年组海马颗粒下层存在着两种DCX阳性细胞，一种扁平的阳性细胞，一种是神经元样向颗粒细胞层伸出长突起的阳性细胞；而老年组几乎未见到阳性细胞。实验结果表明，自然衰老小鼠海马中无论是神经干细胞的数量，还是向神经元方向的分化、迁移，都不同程度的下降。此外，作者统计了不同年龄组小鼠海马齿状回的颗粒细胞层数，结果发现CA区细胞随年龄增加减少明显，而海马齿状回的细胞数量有一定减少但不明显，齿状回细胞数在衰老期还保持在一定的水平。可以推测衰老期海马颗粒下层增殖活跃期的细胞数量的下降和神经干细胞的异常分化是神经发生障碍和新生神经元的减少的主要原因，而向胶质细胞分化增加可能是维持细胞数量的原因，这与Encinas等^[19]的研究结果是一致的。因此，衰老期调控神经干细胞的向神经元方向分化，抑制其胶质化对促进海马颗粒下层神经发生进而改善脑的学习记忆功能显得尤为重要。抑癌基因p53作为一个序列特异性转录因子，在维持哺乳动物细胞基因组的完整性中起着至关重要的作用。由多种细胞应激激活p53下游靶基因，进而调节细胞周期和凋亡。文献提出细胞一旦接收到P19^Arf-Mam2-P53- P21_Cip/Waf1的衰老信号，P21^Cip/Waf1蛋白就成为控制细胞衰老的中心环节，细胞衰老程序开始，增殖停滞并发生一系列的功能和形态的改变^[16]。该通路的下游基因P21^Cip/Waf1所对应的蛋白是细胞周期依赖激酶(CDK)的非特异性抑制剂，具有抑制Rb磷酸化，阻碍E2F释放，使细胞周期停滞的作用。

实验结果表明，随年龄增加，小鼠海马组织p19^Arf、p21^Cip1/Waf1 mRNA表达逐渐增强，这与PCNA免疫染色衰老小鼠增殖活跃细胞数量剧减的结果是一致的，提示自然衰老过程中海马组织神经发生的下降可能与p19^Arf-Mdm2-p53-p21^Cip1/Waf1信号通路中p19^Arf、p21^Cip1/Waf1的表达上调有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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